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Q1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。
（1） 去保護(hù)：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'- OH；
（2） 耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基5'-OH仍然被DMT保護(hù)，3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發(fā)生耦合反應(yīng)；
（3） 封閉：耦合反應(yīng)中極少數(shù)5'- OH沒有參加反應(yīng)，用封閉試劑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)；
（4） 氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成如何處理？
切割與脫保護(hù)基：將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學(xué)切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3’羥基。
純化：根據(jù)所合成寡核苷酸的組成和應(yīng)用來選定純化的方法。常用的純化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。
定量：根據(jù)寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。
儲存：分裝抽干。
Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？
合成的引物5’為羥基，沒有磷酸基團(tuán)。如果需要您可以用多核苷酸激酶進(jìn)行5’端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5’或3’端進(jìn)行磷酸化，需要另外收費(fèi)。
Q4.需要什么級別的引物？
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定訂購引物的純度級別。
應(yīng)用 | 引物長度要求 | 純度級別要求 |
一般PCR擴(kuò)增 | < 60base | HEPD |
>60 base | PAGE | |
診斷PCR擴(kuò)增 | < 40base | HEPD, PAGE |
DNA測序 | 20base左右 | HEPD |
亞克隆，點(diǎn)突變等 | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 | HEPD, PAGE，HPLC |
基因構(gòu)建（全基因合成） | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 | HEPDPAGE |
反義核酸 | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 | HEPDPAGE |
修飾引物 | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定 | PAGE, HPLC |
Q5.需要合成多少OD數(shù)？
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。一般PCR擴(kuò)增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。
Q6.如何計算引物的濃度？
引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul，稱為保存濃度，而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/ul。加水的體積（微升）可直接參照合成報告單上推薦的體積，也可按下列方式計算：
V （微升）= OD數(shù)x 33 x 10000 /引物的分子量
引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。
溶解前您需要核對合成報告單和引物標(biāo)簽上的引物OD數(shù)是否一致。如果不一致，請和我們。我們可以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實(shí)際產(chǎn)量是多少。
Q7.如何計算引物的Tm值？
引物設(shè)計軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成及所使用緩沖夜的離子強(qiáng)度有關(guān)。
長度為25base以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃（G + C）+ 2℃（A + T）
對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 （GC%） – 600/size＊
＊公式中，Size =引物長度。
Q8.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？
非修飾的引物的分子量（MW）在隨引物提供的報告單上可以找到。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù) x堿基的平均分子量，或按下列公式計算MW= （NA * WA） + （NC * WC） + （NG * WG） + （NT * WT） +（Nmod * Wmod）＋（Nx * ）+（ NI* WI） +16* Ns–62.
NA, NG, NC, NT, NI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA, WG ,WC, WT, WI分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個位置增加分子量16。
常規(guī)堿基分子量
Base | Molecular Weight |
A | 313.21 |
C | 289.18 |
G | 329.21 |
T | 304.19 |
I | 314.2 |
U | 290.17 |
常規(guī)修飾基團(tuán)分子量
5’-Biotin | 405.45 | 3’-TAMARA | 623.60 |
5’-（6 FAM） | 537.46 | 3’-Dabsyl | 498.49 |
5’-HEX | 744.13 | 3’-（6 FAM） | 569.46 |
5’-TET | 675.24 | 3’-Amino Modifier C3 | 153.07 |
5’-Cy5 | 533.63 | 3’-Amino Modifier C7 | 209.18 |
5’-Cy3 | 507.59 | 3’-Thiol Modifier C3 | 154.12 |
Q9.如何溶解引物？
干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前瞬時離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或TE（pH8.0）緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。
Q10.如何保存引物？
引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成無色或白色絮狀干粉。
干 粉：運(yùn)輸時常溫運(yùn)輸，-20℃可以保存一年。
儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復(fù)凍融，-20℃可以保存半年。
工作液：常規(guī)使用，4℃保存，也可-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。
Q11.引物定量不準(zhǔn)是怎么回事兒？
我們偶爾收到用戶投訴定量不準(zhǔn)的報告，出現(xiàn)這種情況的可能性有：
（1）定量錯誤、分裝錯誤、引物抽干或收樣過程中意外丟失。這種可能性有，但是很少，因?yàn)樽鳛閷I(yè)的引物合成公司，我們的生產(chǎn)人員都是經(jīng)過嚴(yán)格的專業(yè)培訓(xùn)，這種錯誤是要求謹(jǐn)慎避免甚至杜絕的。一般情況下，引物都有留樣備份，接到用戶投訴后，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題，如確實(shí)存在問題，則可安排重新準(zhǔn)備一份。
（2）系統(tǒng)誤差，我們認(rèn)為10%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏差不影響實(shí)驗(yàn)。
（3）用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導(dǎo)致引物干粉部分丟失。
（4）用戶沒有能夠正確理解引物OD數(shù)的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定；用戶沒有將OD讀數(shù)，正確地轉(zhuǎn)換成母液中OD數(shù)。這種情況比較常見。
例如，驗(yàn)證標(biāo)2OD引物量是否準(zhǔn)確，簡單的做法是：加入1ml水，*溶解混勻后，取100ul,加入900ul水，用光徑為1cm的石英比色杯，波長260nm,此時光吸收的讀數(shù)為0.2。
Q12.zui長可以合成多長的引物？
我們合成過100base的引物，但是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80base。引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗產(chǎn)品，全長引物的百分比不高，后續(xù)處理還有丟失很多，zui后的產(chǎn)量很低。
Q13.為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價格要高?
主要因?yàn)槭切揎梿误w穩(wěn)定性較差，偶連時間長，效率低，zui后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn)品的價格也高。
Q14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？
連接反應(yīng)需要引物的5’磷酸基團(tuán)。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。
Q15.如果測序發(fā)現(xiàn)引物突變，是否有補(bǔ)償？該如何處理？
如果出現(xiàn)測序發(fā)現(xiàn)引物位置堿基錯誤的情況，我們可以免費(fèi)重合一次，沒有其他任何補(bǔ)償或賠償，不承擔(dān)其他連帶責(zé)任，這是行規(guī)。原因我們在前面已提到，化學(xué)合成效率不可能達(dá)到100%。
如果遇到這種情況，首先和我們，我們會檢查合成序列是否和原始訂單一致，如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和*次的引物一樣，都可能含突變，不會因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率?；蚱唇舆^程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。
根據(jù)全基因合成的數(shù)據(jù)，我們的引物能做到2000個堿基的片段，取三個克隆，其中至少有一個是正確的。
Q17.為什么引物的OD260/OD280小于1.5？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T的含量比較高所致。下表是一個20base同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions | |
Base Composition | A260/280 |
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 | 2.50 |
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 | 1.85 |
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 | 1.15 |
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 | 1.14 |
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 | 1.66 |
Q18.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？
通?？梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量（如質(zhì)粒DNA），因?yàn)镋B可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo（dT）等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。
Q19.如何檢測引物的純度？
實(shí)驗(yàn)室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95℃,2mins）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時間后（約2-3小時），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用銀染方式染色。
Q20.已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？
如果您溶解引物的水pH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不*一致。
Q21.引物是我們設(shè)計的，現(xiàn)在您擴(kuò)不出來，我們要負(fù)責(zé)嗎？
不承擔(dān)相關(guān)責(zé)任。我們?yōu)橐恍?shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)不足的客戶，免費(fèi)設(shè)計引物，提供一定的便利。我們遵循一般的引物設(shè)計原則設(shè)計好引物之后都會發(fā)給您確認(rèn)，而后再安排合成并保證引物質(zhì)量。但是設(shè)計的引物是否能夠滿足您的實(shí)驗(yàn)要求，一定擴(kuò)增出您需要的基因片段，誰也不能100%保證。
Q22.PCR擴(kuò)增無目的片段是引物質(zhì)量有問題嗎？
PCR擴(kuò)增無目的條帶或者非特異性擴(kuò)增，影響因素是多方面的，需要耐心地分析，如模板結(jié)構(gòu)與質(zhì)量、反應(yīng)條件、引物設(shè)計等等。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出，擴(kuò)增效率低的問題。如巢式PCR就是擴(kuò)增拷貝數(shù)很低的基因片段。通過提高模板質(zhì)量、優(yōu)化反應(yīng)條件等方面找到對策，或者有必要時重新設(shè)計引物，在實(shí)驗(yàn)時設(shè)置對照來判定原因。如果您懷疑引物的問題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實(shí)驗(yàn)時加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會復(fù)查留存樣品。如不明原因，我們免費(fèi)為您重新合成一次。如果仍然不能擴(kuò)增，請您查找其它原因。多數(shù)情況下我們復(fù)檢引物質(zhì)量都沒有問題，因?yàn)槲覀冊谝锍鍪矍耙呀?jīng)嚴(yán)格把好質(zhì)量關(guān)。
Q23.常用熒光染料參數(shù)
染料 | Excitation | Emission （發(fā)射波長， nm） | 顏色 |
6-FAM | 494 | 518 | Yellow-green |
Fluorescein | 495 | 520 | |
TET | 521 | 536 | |
JOE | 520 | 548 | Yellow |
HEX | 533 | 559 | |
CY3 | 550 | 570 | Yellow-orange |
TAMRA | 544 | 576 | |
ROX | 576 | 601 | Orange |
Cy5 | 650 | 670 | Red |
Q24.引物的質(zhì)量是不是跟序列有關(guān)？
四種堿基的性質(zhì)和各自保護(hù)基的性質(zhì)都有差別。所以合成難度是不一樣的。難度zui大的當(dāng)屬GC重復(fù)多的和序列中還有多個連續(xù)的G的引物。尤其對于后者，國內(nèi)公司一般都做不了20個G以上的引物。實(shí)驗(yàn)證明，如果引物中有超過三個連續(xù)G的結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)方法得到的產(chǎn)物質(zhì)量就會開始下降。而且目前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無效。
我們擁有的HEPD技術(shù)能夠克服高GC或者高G含量引物的合成和純化障礙，對普通引物、高GC引物和無論長短的oligo d（G）都能得到同樣的非常好的結(jié)果
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